核酸DNA提取試劑盒（柱膜法(fa)）使(shi)用說明書

【產品(pin)名稱(cheng)】 通用名稱(cheng)：病毒DNA提取試劑盒

英文名(ming)稱：Extraction Kit for Virus DNA

【預(yu)期用途】 本試劑盒主要用于(yu)疑似病毒(du)等病原(yuan)感染抗凝血、血淸、拭(shi)子、組(zu)織(zhi)、飼料及環境中的(de)病毒(du)DNA的(de)提取，純化的(de)核(he)酸可適用于(yu)各種常規操(cao)作及PCR試驗。

【試劑盒組分】

I、試劑(ji)盒組成(cheng)及(ji)貯藏條件 名稱 20 T 50 T

1、吸附柱(zhu) 20個(ge) 50個(ge) 2、收集(ji)管 20個(ge) 50個(ge) 3、裂解液(ye)(ye) 5 mL 11 mL 4、洗液(ye)(ye)I 13 mL 32 mL 5,洗液(ye)(ye)II 13 mL 32 mL 6.洗脫液(ye)(ye) 1.2 mL 3 mL

2、 保存(cun)條件及有(you)效期：室溫下保存(cun)，有(you)效期12個月.

3、 需自備材料(liao)：無(wu)水(shui)乙醇、1.5 mL無(wu)菌(jun)離心管(guan)、1.5 mL無(wu)菌(jun)離心管(guan)（長臂型）、生理鹽水(shui)、研(yan)缽、無(wu)菌(jun) 1mL, 2OOuL、10uL槍頭、記(ji)號筆等。

【操作步驟】

一、樣品制備

1、 血液(ye)樣(yang)品(pin)：抗凝(ning)血樣(yang)品(pin)置離(li)心管(guan)中，8000轉(zhuan)(zhuan)/分(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)離(li)心2分(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)，取上(shang)層血漿；非(fei)抗凝(ning)血樣(yang)品(pin)置離(li)心 管(guan)中，待(dai)凝(ning)固后(hou)，8000轉(zhuan)(zhuan)/分(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)離(li)心2分(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)，取上(shang)層血清，置于滅菌離(li)心管(guan)中，編(bian)號(hao)待(dai)檢(jian)。

2、 組織樣品(pin)：采集脾(pi)臟(zang)、肝臟(zang)、淋巴(ba)結、扁桃體等病變(bian)組織樣品(pin)0.1g.組織勻漿器或(huo)研(yan)缽中(zhong)充(chong)分(fen)勻漿或(huo)研(yan)磨，加入1 mL生(sheng)理鹽水混勻，8000轉/分(fen)鐘離(li)心2分(fen)鐘，取上清于滅(mie)菌離(li)心骨(gu)中(zhong)，編(bian)號待檢。

3、 口(kou)腔(qiang)液(ye)：進食前用拭子/口(kou)腔(qiang)液(ye)采集袋或自(zi)制棉線綁紗布(bu)團吸引動物咀(ju)嚼，收(shou)集口(kou)腔(qiang)液(ye)大(da)于 500uL， 8000轉/分鐘(zhong)離(li)心2分鐘(zhong)，取上清(qing)于滅(mie)菌離(li)心管中，編號待檢。

4、 飼料：取(qu)適量研(yan)磨(mo)后的飼料（約0.2g），放入含1 mL生理鹽水或PBS（PH為7.4）緩沖液的2 mL EP 管屮，振蕩混(hun)勻，8000轉/分鐘(zhong)離(li)心2分鐘(zhong)，取(qu)上清(qing)于滅菌離(li)心管中,編號待檢.

5、 灰(hui)塵：用無菌(jun)棉簽蘸(zhan)取(qu)適量環境表(biao)面(mian)上(shang)的灰(hui)塵，放入含1 mL生理(li)鹽(yan)水或PBS（PH為(wei)7.4）緩沖液的2 mL EP管中(zhong)，振蕩混勻，8000轉/分鐘離(li)心2分鐘，取(qu)上(shang)清于滅菌(jun)離(li)心管中(zhong)，編號待檢。

二、DNA的提取

1、取(qu)裂解(jie)液(ye)200uL加入(ru)無(wu)核酸酶1.5 mL離心(xin)曾屮，分(fen)別加入(ru)血(xue)漿/血(xue)清/組織液(ye)等(deng)樣(yang)品(pin)液(ye)200uL. 震蕩(dang)混(hun)勻(yun)10秒(miao)或顛倒(dao)混(hun)勻(yun)10次，室(shi)溫放置(zhi)5分(fen)鐘（如果室(shi)內溫度(du)較低(di)時(shi).需放置(zhi)25C水(shui)浴溫育），再加入(ru)200uL無(wu)水(shui)乙醇(chun)，顛倒(dao)混(hun)勻(yun)10秒(miao)；若(ruo)樣(yang)品(pin)渾濁則先(xian)12000轉(zhuan)/分(fen)鐘離心(xin)1分(fen)鐘處理，取(qu)上清液(ye)，以(yi)避免(mian)堵(du)塞柱子；

2、 將液體轉入套有收(shou)集管的吸附柱中， 12000rpm離(li)心(xin)1分鐘：

3、 棄收(shou)集管液體，向吸附柱中加(jia)600uL洗液I , 12000 rpm離心1分鐘;

4、 棄收(shou)集(ji)管液(ye)體，向吸附柱中(zhong)加600uL洗液(ye)II， 12000 rpm離(li)心I分鐘；

5、 棄收集管液體，12000 rpm離心2分鐘，以徹底去除殘留洗液；
6、將吸附柱轉入新的無核酸酸1.5mLEP管（長臂型）中，向柱中央滴加50 uL洗脫液，靜置1分鐘, 12000 rpm離心1分鐘，EP管中液體即為病毒DNA。

【注意事項】
1、 實驗前諾仔細閱讀本試劑盒說明書，嚴格按照操作步驟執行.在操作過程中對時間、試劑體積等 粘確控制可以獲得最好的結果
2, 樣本應新鮮采集使用，或低溫運輸儲存；
3, 樣本具有潛在感染風險，核酸的提取應在核酸提取實驗室的生物安全柜中進行。
4、 核酸提取冇關耗材確保高溫滅菌，提取后核酸盡快進入下一步試驗或冷凍保存待用。
5, 試劑使用前應混合均勻，試劑具有一定腐蝕性，使用時請戴手套、口罩做好防護。
6. 低溫下裂解液出現結晶數屬正常現象，可在60°C水浴加熱助溶后使用。
7、 實驗產生的廢棄物應及時收集，遠離PCR實驗室進行無害化處理。

僅(jin)供獸(shou)醫(yi)診(zhen)斷使用

非洲(zhou)豬(zhu)(zhu)瘟病毒(du)熒(ying)(ying)(ying)光PCR核酸(suan)(suan)檢(jian)測(ce)(ce)(ce)試(shi)劑(ji)盒(he)(he)說明書 【獸藥名(ming)(ming)稱】 通(tong)(tong)用(yong)名(ming)(ming)稱：非洲(zhou)豬(zhu)(zhu)瘟病毒(du)熒(ying)(ying)(ying)光PCR核酸(suan)(suan)檢(jian)測(ce)(ce)(ce)試(shi)劑(ji)盒(he)(he) 漢語拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe 英文名(ming)(ming)稱：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit 商品(pin)名(ming)(ming)稱：無(wu) 【主要成分(fen)(fen)(fen)與(yu)(yu)含(han)量(liang)】試(shi)劑(ji)盒(he)(he)中(zhong)(zhong)含(han)有(you)如(ru)下(xia)組(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen): 試(shi)劑(ji)盒(he)(he)組(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen) 含(han)量(liang) 陽(yang)性對(dui)(dui)照 250μL/管(guan)×1管(guan) 陰性對(dui)(dui)照 250μL/管(guan)×1管(guan) PCR反(fan)(fan)(fan)(fan)應(ying)液(ye) 850μL/管(guan)×1管(guan) 萌(meng)混(hun)(hun)合(he)液(ye) 150μL/管(guan)×1管(guan) 說明書 1份/盒(he)(he) 【作(zuo)用(yong)與(yu)(yu)用(yong)途】 本試(shi)劑(ji)盒(he)(he)可(ke)用(yong)于(yu)(yu)血液(ye)、脾臟(zang)、肝(gan)臟(zang)、淋巴結、 樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)中(zhong)(zhong)非洲(zhou)豬(zhu)(zhu)瘟病毒(du)核酸(suan)(suan)的檢(jian)測(ce)(ce)(ce)。 扁桃體(ti)(ti)、腎臟(zang)、肌(ji)(ji)肉(rou)、環境樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)等 【用(yong)法(fa)與(yu)(yu)判定】 1 用(yong)法(fa) 1.1待檢(jian)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)釆集、保存及運(yun)(yun)輸(shu)(shu) 1.1.1樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)釆集 （1） 活豬(zhu)(zhu)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin) 無(wu)菌(jun)采集抗凝血或(huo)血清5mL （2） 病死(si)豬(zhu)(zhu)剖(pou)檢(jian)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)或(huo)屠宰場剖(pou)檢(jian)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin) 無(wu)菌(jun)采集死(si)豬(zhu)(zhu)的牌、肺、腎、扁桃體(ti)(ti)、淋巴結、肌(ji)(ji)肉(rou)等組(zu)(zu)織(zhi)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)。2?8°C低(di)溫運(yun)(yun)至(zhi)實驗室(shi)用(yong)于(yu)(yu)檢(jian)測(ce)(ce)(ce)。 （3） 病豬(zhu)(zhu)污(wu)染的周邊環境 采集與(yu)(yu)病豬(zhu)(zhu)相關場所的糞(fen)(fen)便(bian)(bian)、飼(si)料、污(wu)水樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)。2?8°C低(di)溫運(yun)(yun)至(zhi)實驗室(shi)用(yong)于(yu)(yu)檢(jian)測(ce)(ce)(ce)。 1.1.2樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)保存 采集的樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)在2?8°C保存應(ying)不超過24小時，-70°C條件下(xia)保存，避免反(fan)(fan)(fan)(fan)復凍 融。 1.1.3樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)運(yun)(yun)輸(shu)(shu)泡沫箱(xiang)加(jia)(jia)冰袋后密封進行運(yun)(yun)輸(shu)(shu)。包裝和(he)(he)運(yun)(yun)輸(shu)(shu)應(ying)符合(he)農業農村部《高致病性動 物(wu)病原(yuan)微(wei)生物(wu)菌(jun)（毒(du)）種或(huo)者樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)運(yun)(yun)輸(shu)(shu)包裝規(gui)范》和(he)(he)交通(tong)(tong)運(yun)(yun)輸(shu)(shu)部門(men)關于(yu)(yu)危險品(pin)運(yun)(yun)輸(shu)(shu)管(guan)理(li)的有(you)關規(gui)定。 1.2樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)處(chu)(chu)理(li) 1.2.1血液(ye)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)處(chu)(chu)理(li) 抗凝血樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)置于(yu)(yu)離心管(guan)中(zhong)(zhong)，8000 r/min離心2分(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)取(qu)(qu)上(shang)層(ceng)血漿(jiang)(jiang)，編(bian)號(hao)(hao)待 檢(jian)。非抗凝血樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)置于(yu)(yu)離心管(guan)中(zhong)(zhong)，待凝固后，8000 r/min離心2分(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)取(qu)(qu)200μL上(shang)層(ceng)血清，編(bian)號(hao)(hao)待檢(jian)。 1.2.2組(zu)(zu)織(zhi)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)處(chu)(chu)理(li)取(qu)(qu)適(shi)量(liang)脾臟(zang)、肝(gan)臟(zang)、淋巴結、扁桃體(ti)(ti)、肌(ji)(ji)肉(rou)等組(zu)(zu)織(zhi)，置于(yu)(yu)研(yan)磨器或(huo)研(yan)磨管(guan)中(zhong)(zhong)研(yan)磨，再加(jia)(jia)適(shi)量(liang)生理(li)鹽水混(hun)(hun)勻，制成約(yue)10%的組(zu)(zu)織(zhi)勻漿(jiang)(jiang)，8000 r/min離心2分(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)，取(qu)(qu)200μL上(shang) 清于(yu)(yu)RNase/DNase-free無(wu)菌(jun)離心管(guan)中(zhong)(zhong)，編(bian)號(hao)(hao)備(bei)用(yong)。 1.2.3環境樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)處(chu)(chu)理(li) 1.2.3.1糞(fen)(fen)便(bian)(bian)、飼(si)料樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)處(chu)(chu)理(li)方(fang)法(fa)取(qu)(qu)適(shi)量(liang)的糞(fen)(fen)便(bian)(bian)、飼(si)料放入(ru)盛有(you)PBS緩沖液(ye)的研(yan)磨管(guan)中(zhong)(zhong)研(yan)磨混(hun)(hun)勻，制成約(yue)10%的勻漿(jiang)(jiang)液(ye).8000 r/min離心2分(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)，取(qu)(qu)200μL上(shang)清于(yu)(yu)RNase/DNase-free無(wu)菌(jun)離心 管(guan)中(zhong)(zhong)，編(bian)號(hao)(hao)備(bei)用(yong)。 1.2.3.2污(wu)水樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)處(chu)(chu)理(li)方(fang)法(fa) 直(zhi)接取(qu)(qu)200μL污(wu)水進行核酸(suan)(suan)提取(qu)(qu)。 1.3病毒(du)核酸(suan)(suan)的提取(qu)(qu)用(yong)磁珠法(fa)或(huo)柱式(shi)法(fa)進行DNA核酸(suan)(suan)提取(qu)(qu)。 1.4熒(ying)(ying)(ying)光PCR反(fan)(fan)(fan)(fan)應(ying)： 1.4.1從試(shi)劑(ji)盒(he)(he)中(zhong)(zhong)取(qu)(qu)出熒(ying)(ying)(ying)光PCR反(fan)(fan)(fan)(fan)應(ying)液(ye)、酶混(hun)(hun)合(he)液(ye)，室(shi)溫融化后，2000 r/min離心5秒。設(she)被 檢(jian)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)、陽(yang)性對(dui)(dui)照和(he)(he)陰性對(dui)(dui)照總和(he)(he)為n,則反(fan)(fan)(fan)(fan)應(ying)體(ti)(ti)系(xi)配(pei)制如(ru)下(xia)：

試劑 體系

PCR 反應液 17× (n+1) μL

酶混合液        3× (n+1) μL

1.4.2在新的RNase/DNase-fire 1.5 ml離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20μL/ 管分裝量將試劑分裝至熒光PCR反應管。

1.4.3在上述制備好(hao)的(de)熒光(guang)(guang)PCR反(fan)應(ying)管中分別加(jia)入(ru)陰(yin)性對(dui)(dui)照、陽性對(dui)(dui)照各(ge)5μL、處理好(hao)的(de)待測核(he)酸各(ge)5μL,終體積25μL/管，蓋好(hao)熒光(guang)(guang)PCR反(fan)應(ying)管蓋，混勻后瞬時(shi)離心(xin)，轉移到(dao)熒光(guang)(guang)PCR儀器 上。

144將PCR反應管放置在熒光PCR儀樣品槽中，在熒光PCR儀上運行以下程序：

步(bu)驟 條件 循環數 UNG處理(li) 50 ℃, 2分鐘 1 預(yu)(yu)變性(xing) 95 ℃, 3分鐘 1 預(yu)(yu)擴(kuo)增(zeng) 95 ℃： 8 秒(miao)(miao) 55 ℃： 8 秒(miao)(miao) 5 PCR擴(kuo)増(zeng) 95 ℃： 8 秒(miao)(miao) 55 ℃： 8 秒(miao)(miao) 40

熒光通道選擇FAM,在PCR擴增階段每個循環的55℃時采集熒光信號。設置擴增體系為25μL, 同時要選擇passive reference和quencher為none的模式。（注：若熒光PCR儀（如AB17500）按說明 書中的反應程序設置后因持溫時間短無法運行，可將預擴增和PCR擴增條件變更為95C： 5秒 55°C： 30 秒）

2結果判定

2.1試驗有效性判定

陽(yang)性對照有典型擴增曲(qu)線且Ct值(zhi)≤30.且陰性對照無(wu)Cl值(zhi)或無(wu)擴增曲(qu)線，線形為直線或輕(qing)微斜線，無(wu)指數增長期。則判試驗結果有效(xiao)。否則，此次試驗視為無(wu)效(xiao)。

2.2樣品判定

2.2.1陽性：樣本檢測結果Ct值≤35且有明顯指數增長期，判定檢出非洲豬瘟病毒核酸。

2.2.2可疑：樣本檢測結果Ct值在35?38范圍內。此時應對樣本進行重復檢測，如果重復實驗 結果Ct值仍在35?38范圍內，有明顯指數增長期.則判定為陽性，否則為陰性。

2.2.3陰性：樣本檢測結果Ct值＞38或無Ct值，判定未檢出非洲豬瘟病毒核酸。

【注意事(shi)項】（1）實驗(yan)前(qian)請仔細閱讀(du)本試(shi)劑盒說明書，嚴格按照操作(zuo)步(bu)驟執行，在(zai)操作(zuo)過 程中對(dui)時間、試(shi)劑體積等精確控制可以獲(huo)得最好的結果(guo)。

（2） 實驗室應(ying)嚴格按照有(you)(you)關規定分區(qu)(qu)管理，依照配液區(qu)(qu)-模板(ban)提取(qu)區(qu)(qu)-擴增區(qu)(qu)-分析(xi)區(qu)(qu)順序 進(jin)行基因檢(jian)測。各區(qu)(qu)間人員、器材(cai)、試劑(ji)及空氣流向應(ying)有(you)(you)嚴格要(yao)求。

（3） 核酸提取有關耗村確保(bao)潔凈、無DNase/RNase,提取過程(cheng)盡(jin)量低溫、快速(su)，完成后進入 下一步實驗或凍保(bao)。

（4） 對于頂部采光儀器要帶新的一次性PE手套對熒光PCR管封蓋，對于底部采光儀

器要避免徒手或使用過的手套接觸熒光PCR管底，檢測過程中使用不帶熒光物質一次性乳膠手套。

（5） 凍存試劑使用前應于(yu)室溫下(xia)完(wan)全(quan)融(rong)化，瞬(shun)時離心使液體完(wan)全(quan)沉(chen)于(yu)管底。避免反復(fu)凍融(rong)， 以免影響試劑性(xing)能。

（6） 樣品、陽性對照等在使用后及時封蓋，.避免組分間及氣溶膠等的污染造成假陽性。

（7） 擴(kuo)增產物(wu)禁止開(kai)蓋，實(shi)驗產生的廢棄物(wu)應及(ji)時收集(ji)，遠離PCR實(shi)驗室進行無害化處(chu)理。

【規格】50頭份/盒

【貯藏與有效期】試劑盒置-20°C以下避光保存，有效期12個月。

【批準文號】獸藥生字163668871

【生產企業】鄭州中道生物技術有限公司

僅(jin)供獸醫診斷使用(yong)